style="width:2.84679in;height:0.65318in" />
style="width:3.09994in" />GB/T 34800—2017 本文是学习GB-T 34800-2017 蛋白酶K酶活力及杂质检测方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了蛋白酶 K
检测原理、仪器设备及器具、主要试剂、分析步骤和结果分析。
本标准适用于生化试剂蛋白酶K 产品的生产和检测。
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件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 34222 核糖核酸酶活力检测方法
GB/T 34801 脱氧核糖核酸酶活力检测方法
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
蛋白酶 K proteinase K
能水解天然角蛋白(keratin)的一种丝氨酸蛋白酶。
注：按产品形态分为固态和液态。
3.2
蛋白酶 K 酶活力单位 proteinase K activity
unit
在57℃和pH8.0 条件下，在1 min 内水解牛血红蛋白产生1μmol
酚基氨基酸的酶量。
注： 一个酶活力单位以U 表示。
蛋白酶 K 可催化脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键断裂。它在57℃和
pH 8.0条件下，
水解牛血红蛋白底物产生含有酚基的氨基酸；在碱性条件下，可将福林(Folin)试剂还原，生成钼蓝与钨
蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在680 nm
测定其吸光度，得到水解产生的酚基氨基
酸的量，进而计算蛋白酶 K 酶活力。
5.1 恒温水浴锅：精度为±0.1℃。
5.2 pH 计：精度为0.1 pH 单位。
5.3 分光光度计：波长范围380 nm～780 nm,吸光度值精确至0.001。
GB/T 34800—2017
5.5 电子天平：精度为0.0001 g、0.01 g和0.1 g。
5.6 高速离心机：最小离心力为8000g, 具1.5 mL 离心管。
本方法所用试剂均为分析纯，除特殊说明外，实验用水均为GB/T 6882
规定的二级水。
6.1 0.01 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(Tris-HCI),pH
8.0
称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.11g,加入适量水使其溶解，定容至100mL,
用浓盐酸调至pH8.0, 即 成 1 mol/L Tris-HCl 缓冲液。再取1 mL1 mol/L
Tris-HCl 缓冲液，加水定容至100 mL, 即成
0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液。
6.2 0.4 mol/L 三氯乙酸溶液
称取三氯乙酸65.40 g,用水溶解并定容至1000 mL。
取8.50 mL 浓盐酸加入到50 mL 水中稀释，然后定容至100 mL, 得1 mol/L
HCl溶液。
取10.00 mL1 mol/L HCl溶液加水定容至100 mL, 得0.1 mol/L HCl溶液。
准确称取牛血红蛋白(BR, 分子质量64.5 kD)1.000g, 用0.01 mol/LpH8.0 的
Tris-HCl 缓冲液溶
解，并定容至100 mL。 此溶液在4℃冰箱贮存，有效期为3天。
称取无水碳酸钠42.40 g,用水溶解并定容至1000 mL。
于2000 mL 磨口回流装置加入钨酸钠(Na₂WO ·2H₂O)100.0 g、钼酸钠(Na₂MoO₄
·2H2O)25.0 g、
水700 mL、85% 磷酸50 mL、 浓盐酸100 mL。 小火沸腾回流10 h。
取下回流冷却器，在通风橱中加入 硫酸锂(Li₂SO₄)50g、 水50 mL
和数滴浓溴水。再微沸15 min, 以除去多余的溴，至冷却后无绿色。加
水定容至1000 mL。
混匀，过滤。试剂应呈金黄色。贮存于棕色瓶内，避光保存。使用时，用1份福林
试剂与2份水混匀，制成稀福林试剂。也可将商品化福林试剂按照产品使用指南稀释成稀福林试剂。
6.8 100 μg/mLL-酪氨酸标准溶液
称取纯度≥95%的 L-酪氨酸0.1000 g,105℃ 干燥至恒重，用20 mL1mol/L
HCl溶液溶解后，再
用水定容至100 mL, 即为1 mg/mLL-
酪氨酸标准储备溶液，在4℃冰箱贮存。临用前，吸取1 mg/mL
L-酪氨酸标准储备溶液10.00mL, 用0.1 mol/L 盐酸溶液定容至100mL,
即得到100μg/mL 的 L-酪氨
酸标准溶液。
7.1 核糖核酸酶(RNase) 酶活力
按GB/T 34222进行检测。
GB/T 34800—2017
7.2 脱氧核糖核酸酶(DNase) 酶活力
按 GB/T 34801 进行检测。
按表1,在10 mL 容量瓶中配制 L-酪氨酸标准工作溶液。
表 1 L-酪氨酸标准工作溶液配制
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100 μg/mL酪氨酸
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分别吸取L-酪氨酸标准工作溶液1.0 mL
于具塞试管中，每个浓度作2个平行，然后加入5.0 mL 碳酸钠溶液和1.0 mL
稀福林试剂，混匀。将标准管同时置于40℃水浴，反应20 min,取出，用冷水迅
速冷却至室温，用分光光度计，在680 nm
波长下，以不含酪氨酸的0号管为空白，用1cm 比色皿，测定
吸光度(A)。
以吸光度A 为纵坐标，以 L-酪氨酸的浓度 C
为横坐标，绘制标准曲线，此线应通过零点。得出线
性回归方程和回归系数(R²)。
回归系数在0.9990及以上时，方可使用，否则应重做。
新配制的福林试剂应制作新的标准曲线。
称取0.0050g 固体酶，精确至0.0001 g,用0.01mol/L pH8.0 的 Tris-HCl
缓冲液溶解，并稀释至
酶浓度曲线中呈线性关系的酶浓度范围内。
吸取100 μL 液体酶，用0.01 mol/LpH8.0 的 Tris-HCl
缓冲液稀释至酶浓度曲线中呈线性关系的
酶浓度范围内。
取3支10 mL
具塞试管，样品空白管1支，样品管2支。分别向3支试管中准确加入稀释好的待测
酶液1.0 mL, 在57℃下水浴预热5 min。 向2支样品管中加入1.0 mL
经同样预热的1%牛血红蛋白溶 液，准确计时反应10
min;迅速、准确地向3支试管中加入2.0 mL0.4 mol/L 三氯乙酸溶液；于样品空
白管中加入1.0 mL1% 牛血红蛋白溶液，混匀。3支试管继续在57℃下水浴10
min,取出，迅速冷却至
室温，11000 g 离心5 min。
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另取3支10 mL
具塞试管，样品空白管1支，样品管2支，分别吸取上述相应上清液1.0 mL 于 3
支 试管，然后均加入5.0 mL 碳酸钠溶液、1.0 mL
稀福林试剂，混匀，40℃水浴20 min 显色。迅速冷却至
室温。与此同时，另取1支试管，用水代替上清液做试剂空白，均加入5.0 mL
碳酸钠溶液、1.0 mL 稀福
林试剂，混匀，40℃水浴20 min 显色，迅速冷却至室温。
以试剂空白管调仪器零点，用分光光度计于波长680 nm 下，用1 cm
比色皿，分别测定样品空白管 (A。)和样品管中样液的吸光度(A) 。
将样品管与样品空白管吸光度之差取平均值，经线性回归方程求
解生成的酪氨酸浓度(C-Co)。
按照式(1)计算：
式中：
…
……
………
(1)
X - 蛋白酶 K 样品的酶活力(U/mL 或 U/g);
C —— 样品管的酪氨酸浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);
Co—— 样品空白管的酪氨酸浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);
4 — 反应体系的总体积，单位为毫升(mL); N ——样品溶液的稀释倍数；
M— L- 酪氨酸的摩尔质量(181.20 g/mol); 10— 反应时间，单位为分(min);
Cs— 蛋白酶K 样品溶液的浓度，单位为毫升每毫升或克每毫升(mL/mL 或
g/mL)。
以平行样的平均值为最终的酶活力测定值，计算结果保留整数位。
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
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